Skrining Tanaman Induk, Analisis Hasil Perbanyakan Vegetatif In Vivo Dan In Vitro Jeruk Keprok Brastepu Bebas Penyakit Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD)

Abstract

Screening of mother plants, analysis of in vivo and in vitro vegetative propagation of Brastepu citrus (Citrus nobilis Brastepu) free from citrus vein phloem degeneration (CVPD) diseases is explained in this Dissertation. The development of agriculture sector with the basis on local plants are needed to be encouraged, and the focused on horticulture plants that has economic potential such as citrus is very urgent to be done. North Sumatra is the Province in Indonesia that can be planted with citrus. One of the prospect plant is Brastepu citrus that commonly known as "Jeruk Brastagi". The citrus is very popular due to its phenotype and genetic properties, where the citrus sweet taste, the fruit is big in size with reddish color, and with high quantity production. However, this current local citrus becomes a rare plant because it is sensitive to CVPD that make the citrus is not planted anymore. Replantation of Brastepu citrus has to be done soon to avoid the plant from deminished. Brastepu citrus become the plant heritage in Indonesia need to be conserved biologically (bioconservation) to assure the continuation of the plant. It is predicted that the plant will dissapear in a short time if there is no action been conducted. This research is aimed to screen survive Brastepu citrus for the status on CVPD infection in order to have a healthy mother plant to be used as a sources of bud stick for vegetative in vivo and in vitro propagation to obtain citrus seedling that is free from CVPD to be planted for replantation of Brastagi citrus. The study is conducted in the Laboratory Department of Biology FMIPA USU, and field study in Brastagi, Kabupaten Karo of North Sumatra. The research is the combination of survey and experimental works. The survey is conducted to collect survive Brastepu citrus in Brastagi. The experiment is carried out for in vivo and in vitro propagation to obtain Brastepu citrus seedling free from CVPD. The works are conducted in three parts, they are: (1) screening of Brastepu citrus directly in the field to investigate the status of CVPD infection by using visual identification, iodine test, and histoanatomy, and followed by analysis by using Polymerase Chain Reaction (PCR) in the laboratory, (2) propagation of Brastepu citrus by cutting bud techniques by using the scion that is free from CVPD to obtain citrus seedling free from CVPD and compared with the propagation of the citrus by using by using the scion that is positively infected CVPD, and (3) in vitro propagation via shoot tip culture and subculture. The experiment was carried out by completely randomized design (CRD) with variation on the concentration of growth stimulator of auxin (0.5 – 1.0 mg/L 2,4-D) and cytokinin (0.5 – 3.0 mg/L BAP) that influencing the growth and development of callus, embryosomatic, and tuber of the citrus. Investigation for CVPD infection on Brastepu citrus was conducted successively through visual investigation for the growth and development of the plants, they are seen from leaves and stem appearance, fruit formation, carpel fruit taste, and shape of seeds, the iodine test, and hystochemical test for leave tissue. The confirmation for the presence of CVPD infection is carried out by analysis citrus DNA by using PCR compare to positive control of CVPD (C+) and control negative of CVPD (C-) standards, and the size of single band that produced by PCR compared to the ladder (M/L). The stability of citrus genetic was examined by using Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) by using 20 primers RAPD, SSR and ISSR.Screening of CVPD for 20 survived Brastepu citrus plants has been conducted, where the plants are grown in differents areas in Kabupaten Karo. The plants are estimated between 10 to 30 years old with the living conditions are varied depends on the condition of the plants. The results for CVPD from visual investigation and laboratory analysis are consistent one to another. Identification from phenotype appearance on the leaves, stem, fruit, carpel fruit taste, and the shape of seeds can be used to predict CVPD infection. Amylum test for leave tissues, both via iodine test and hystochemical followed by analysis by PCR support the results of visual investigation on CVPD infection. There are 12 plants are free from CVPD (plants no 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, and 14), and eight plants are positively infected by the the CVPD (plants no 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, and 20). All Brastepu citrus grown in Desa Bukit are healthy and free from CVPD, and therefore, they can be used as mother plants as sources of bud stick for vegetative in vivo and in vitro propagation to obtain citrus seedling that is free from CVPD in the next experiments. Citrus propagation via cutting bud method by using bud stick from healthy plants and free from CVPD onto a lemon citrus (C. aurantium) root stock has successfully been conducted. The strategy to obtain optimum condition for the growth and development of Brastepu citrus seedling has been achieved. The success on citrus propagation was influenced by the strategy to store the bud stick and the storage length time. It is found that the best results are obtained when the occulation of Brastepu citrus was carried out at the day the bud stick obtained. The longer bud stick stored in banana sheat results in poor growth of the plants, where slow growth plant achieved. The bud stick obtained from young plant was found to give better results on the Brastepu citrus propagation. It is therefore recommended that the propagation of Brastepu citrus has to be conducted by using bud stick form young plant and has to be conducted soon after taking the bud stick form mother plants. The results from PCR analysis reveals that all plants that are propagated by using healthy bud stick produce healthy citrus seedling and free CVPD. The plants that are propagated by using unhealthy bud stick produce CVPD infectious citrus seedling, where the leaves are chlorosis with blotchy mottle, and some are spongy phloem and die back plants, some are yellow leaves, and some are defoliation. In vitro propagation of Brastepu citrus with shoot tip and subculture has been carried out to obtain citrus seedling through four steps, they are (1) without subculture, (2) subculture one time, (3) subculture two times, and (4) subculture three times. In the first treatment, the best weight of callus (1.83 g) was obtained in D1B1 where the shoot tip explant of Brastepu citrus was treated by using combination of 0.5 mg/L 2,4-D dengan 0.5 mg/L BAP. The embryosomatic was obtained in D1B2 when treatment combination is performed by using of 1.0 mg/L 2,4-D dengan 0.5 mg/L BAP. The best condition of shoot was also produced in the treatment combination of 0.5 mg/L 2,4-D dengan 1.5 mg/L BAP, where the average is 1.10 shoot. Statistical analysis with Duncan (P = 0.05) showed that the variation in treatment conditions were significantly influenced the growth and development of callus, embryosomatic, and the shoot of Brastepu citrus. Subculture at second treatments with two times subculture produce callus at D1B1 by using 0.5 mg/L 2,4-D dan 0.5-1.0 mg/L BAP, where the callus was obtained 2.82 g. The best embryosomatic was obtained in D1B2 by using 0.5 mg/L 2,4- D dan 0.5 - 1.0 mg/L BAP, with 24,80 embryosomatic. The best condition to obtain tuber was in D1B2 by using 0.5 mg/L 2,4-D dan 0.5-1.0 mg/L BAP, where there are 4.00 shoots. Statistical analysis with Duncan (P = 0.05) showed that the variation in treatment conditions are significantly influenced the growth and development of callus, embryosomatic, and the shoot of Brastepu citrus. Direct embryogenesis has also been performed in MS basal media that is enriched with malt extract and growth stimulator, where the plantlet and true to type clone that can grow become somatic cell. The growth and development of embryosomatic directly produce plantlets. Plantlet indicates shoot with a single big root. Confirmation test for in vitro culture has been performed and the results showed that all plants are free from CVPD. The DNA band profile from RAPD analysis reveals that the isolated DNA from in vitro propagation has similar genetic properties with original plants of Brastepu citrus. It is concluded that cutting bud propagation of Brastepu citrus by using bud stick from healthy plants and free from CVPD onto a sour citrus (C. aurantium) root stock can be used to produce Brastepu citrus seedling as a first step in the bioconservation of the citrus. The seedling results from cutting bud technique can be used as a source of explant for in vitro propagation of Brastepu citrus for mass production of healthy and CVPD free of Brastepu citrus. It is suggested for shoot tip in vitro propagation to use with subculture one time because the strategy can produce good quality seedling. Future study need to be conducted to obtain better quality seedling of Brastepu citrus to be used in the replantation of local citrus in national plantation as the strategy for bioconservation of local citrus.

Skrining tanaman induk dan perbanyakan vegetatif in vivo dan in vitro dari Citrus nobilis Brastepu atau jeruk Brastepu bebas penyakit citrus vein phloem degeneration (CVPD) dijelaskan dalam disertasi ini. Pembangunan sektor pertanian yang berorientasi pada peningkatan produk lokal unggulan sangat perlu mendapat perhatian, terutama terhadap potensi tanaman hortikultura penghasil buah yang memiliki nilai ekonomi tinggi seperti jeruk. Propinsi Sumatera Utara termasuk salah satu daerah yang cukup baik untuk ditanami jeruk. Produk jeruk yang berasal dari Sumatera Utara antara lain adalah "Jeruk Brastagi", yaitu jeruk Brastepu. Di pasaran lokal, jeruk Brastagi mempunyai harga jual tinggi karena memiliki keunggulan genetika seperti cita rasa manis segar, bentuk buah dan warna yang menarik, ukuran buah besar, dan kuantitas buah banyak. Akan tetapi, jeruk lokal ini sudah sangat langka, bahkan budidaya tanaman tidak banyak yang dilanjutkan karena rentan terhadap penyakit CVPD. Budidaya jeruk Brastepu sangat mendesak agar varietas ini tidak sampai mengalami kepunahan. Pengembangbiakan jeruk Brastepu juga merupakan aset berharga dalam keanekaragaman hayati Indonesia sehingga perlu dikonservasi secara biologi (biokonservasi) agar jeruk lokal ini tidak punah. Bila biokonservasi tidak segera dilakukan maka diperkirakan jeruk lokal Brastagi akan punah dalam waktu beberapa tahun lagi. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan skrining terhadap tanaman induk jeruk Brastepu yang masih bertahan hidup dari serangan CVPD dan erupsi Gunung Sinabung, serta melakukan biokonservasi melalui perbanyakan secara vegetatif in vivo dan in vitro untuk penyediaan bibit jeruk Brastepu bebas CVPD, sehingga dapat digunakan sebagai sumber bibit mengatasi kelangkaan jeruk lokal Brastagi. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi FMIPA USU, dan di areal perkebunan jeruk di Kecamatan Brastagi, Kabupaten Karo, Sumatera Utara. Isolasi DNA dan PCR dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian, UGM, Yogyakarta dan Horticulture Laboratory, Horticulture Department, College of Agriculture, Funchess Hall, Auburn University, Auburn-USA. Penelitian adalah gabungan antara survey dan eksperimental. Survey dilakukan untuk mendapatkan tanaman induk jeruk keprok Brastepu yang masih bertahan hidup dari serangan CVPD di Kecamatan Brastagi. Eksperimen dilakukan dalam mempelajari perbanyakan tanaman secara vegetatif in vivo dan in vitro untuk menghasilkan bibit yang bebas CVPD. Penelitian dilakukan dengan tiga tahap yaitu: (1) Melakukan skrining tanaman induk jeruk Brastepu secara langsung di lapangan melalui identifikasi visual, dan secara tidak langsung melalui teknik sambung, uji iodium, histokimia daun yang diamati dengan mikroskop, dan Polymerase Chain Reaction (PCR), (2) Melakukan perbanyakan secara okulasi menggunakan mata tempel tanaman yang sehat dan bebas CVPD dan dibandingkan dengan mata tempel tanaman yang terserang CVPD, dan (3) Melakukan kultur meristem pucuk (shoot tip) dan subkultur untuk perbanyakan tanaman jeruk Brastepu. Percobaan dilakukan dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan variasi konsentrasi zat pengatur tumbuh auksin (0,5 - 1,0 mg/L 2,4-D) dan sitokinin (0,5 - 3,0 mg/L BAP) yang mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan kalus, embriosomatik, dan tunas tanaman. Konfirmasi infeksi CPVD di dalam tanaman dan kultur dilakukan secara visual dan PCR pada DNA hasil isolasi dengan menggunakan kontrol positif CVPD (C+), kontrol negatif CVPD (C-), dan penentuan ukuran pita dibandingkan dengan ladder (M/L). Kestabilan genetik kultur jeruk keprok Brastepu untuk semua kelompok perlakuan diuji menggunakan Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) dengan 20 Primer RAPD, SSR dan ISSR. Skrining tanaman induk telah dilakukan untuk melihat infeksi CVPD pada jeruk keprok Brastepu. Sebanyak 20 pohon jeruk keprok Brastepu yang bertahan hidup di Kabupaten Karo berumur antara 10 - 30 tahun dengan kondisi bervariasi. Identifikasi dan konfirmasi CVPD pada tanaman memberikan hasil yang konsisten satu dengan yang lain dan saling mendukung. Identifikasi secara visual pada pertumbuhan dan perkembangan tanaman, melalui bentuk daun dan pucuk, keadaan buah, keadaan daging buah dan biji dapat digunakan sebagai indikasi infeksi CVPD. Akumulasi amilum melalui uji iodium, analisis histokimia daun memperkuat hasil identifikasi terhadap infeksi CVPD, dan analisis DNA dengan PCR digunakan untuk konfirmasi spesies penyebab CVPD. Tanaman induk jeruk keprok Brastepu diketahui 12 pohon sehat dan bebas CVPD (pohon nomor 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, dan 14), dan 8 pohon lainnya positif atau terinfeksi CVPD jeruk (pohon nomor 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, dan 20). Semua pohon jeruk dari Desa Bukit sehat dan bebas CVPD sehingga dapat digunakan sebagai tanaman induk pada studi lanjutan. Perbanyakan jeruk Brastepu secara okulasi menggunakan mata tempel dari tanaman jeruk yang sehat dan bebas CVPD pada batang bawah jeruk asam (C. aurantium) telah berhasil dilakukan. Strategi yang baik dan kondisi optimum dalam teknik okulasi untuk menempelkan mata tunas jeruk Brastepu pada batang pohon jeruk asam telah ditemukan dan menghasilkan bibit jeruk yang tumbuh dan berkembang dengan baik. Keberhasilan tanaman induk batang bawah menyatu dengan mata tempel sangat dipengaruhi oleh lama penyimpanan bud stick. Okulasi dengan menggunakan bud stick pada hari yang sama dengan pengambilan mata tempel sangat tepat dalam teknik okulasi jeruk Brastepu. Semakin lama bud stick disimpan di dalam pelepah pisang maka akan semakin berkurang kemampuan penyesuaian diri untuk menyatu dengan batang bawah. Umur bud stick dan lama penyimpanan berpengaruh terhadap pertumbuhan dan pertambahan jumlah tunas, daun, dan cabang jeruk Brastepu. Semakin muda umur bud stick yang digunakan maka semakin sempurna pertumbuhan daun jeruk pada tanaman okulasi. Dengan demikian sangat baik apabila mata tempel diambil dari bud stick tanaman induk muda, sehat dan langsung ditempel pada batang bawah. Hasil analisis DNA dengan teknik PCR menunjukkan bahwa semua tanaman hasil okulasi dari pohon sehat menghasilkan tanaman bebas CVPD. Tanaman yang diokulasi menggunakan mata tempel yang terinfeksi CVPD menghasilkan bibit jeruk dengan gejala klorosis, bercak-bercak (blotchy mottle), beberapa disertai dengan berkas pengangkut yang bergabus dan mati pucuk (die back), sebagian daun mengering, dan banyak daun yang rontok. Untuk itu diperlukan pertimbangan matang dalam memilih mata tempel, yaitu harus bebas dari gejala CVPD agar diperoleh bibit tanaman berkualitas baik yang bebas penyakit CVPD. Kultur meristem pucuk (shoot tip) dan subkultur jeruk keprok Brastepu telah dilakukan untuk mendapatkan bibit jeruk Brastepu melalui empat cara yaitu: (1) tanpa subkultur, (2) subkultur 1 kali, (3) subkultur 2 kali, dan (4) subkultur 3 kali. Pada perlakuan 1, eksplan pucuk jeruk Brastepu diperoleh bobot kalus tertinggi pada perlakuan D1B1, menggunakan kombinasi 0,5 mg/L 2,4-D dengan 0,5 mg/L BAP, dengan bobot kalus 1,83 g. Rataan jumlah embriosomatik tertinggi diperoleh pada kelompok D1B2 menggunakan kombinasi 1,0 mg/L BAP dengan 0,5 mg/L 2,4-D diperoleh 20,60 embriosomatik. Kondisi terbaik di dalam menghasilkan tunas adalah pada kelompok perlakuan D1B3 melalui pemberian 0,5 mg/L 2,4-D dan 1,5 mg/L BAP dengan rata-rata 1,10 tunas. Analisis statistik menggunakan uji jarak Duncan (P = 0,05) menunjukkan bahwa pengaruh perlakuan berbeda nyata terhadap pertumbuhan dan perkembangan kalus, embriosomatik dan tunas jeruk keprok Brastepu. Dengan subkultur, kondisi paling baik diperoleh pada perlakuan 2 dengan dua kali subkultur, yaitu bobot kalus tertinggi diperoleh pada perlakuan D1B1 menggunakan 0,5 mg/L 2,4- D dan 0,5-1,0 mg/L BAP, dengan bobot kalus 2,82 g. Jumlah embriosomatik tertinggi diperoleh pada kelompok D1B2 menggunakan 0,5 mg/L 2,4-D dan 0,5-1,0 mg/L BAP dihasilkan 24,80 embriosomatik. Kondisi terbaik di dalam menghasilkan tunas adalah pada perlakuan D1B2 dihasilkan rata-rata 4,00 tunas. Analisis statistik menggunakan uji jarak Duncan (P = 0,05) menunjukkan bahwa pengaruh perlakuan berbeda nyata terhadap pertumbuhan dan perkembangan kalus, embriosomatik dan tunas jeruk keprok Brastepu. Teknik embriogenesis langsung di dalam media padat MS basal yang diperkaya dengan ekstrak malt dan zat pengatur tumbuh dapat menghasilkan planlet atau organ dan klon true to type yang langsung berkembang dari satu sel somatik. Pertumbuhan dan perkembangan embriosomatik pada kultur langsung dapat menghasilkan planlet dan tunas di dalam media, tetapi belum memiliki akar yang sempurna, masih berupa akar tunggal yang membesar. Konfirmasi PCR menunjukkan bahwa semua kultur jeruk keprok hasil in vitro bebas dari CVPD. Analisis RAPD terhadap profil pita DNA menggambarkan bahwa DNA sampel jeruk yang diperbanyak secara in vitro tidak menunjukkan perbedaan genetik. Penyediaan bibit jeruk keprok Brastepu sebagai langkah awal biokonservasi dapat dilakukan melalui perbanyakan secara okulasi dari sumber tanaman yang masih hidup dan bebas CVPD. Cara ini dapat digunakan sebagai sumber bibit mengatasi kelangkaan jeruk lokal di Sumatera Utara dan sekaligus untuk penyediaan bahan eksplan untuk perbanyakan massal secara teknik in vitro. Mata tempel yang digunakan dalam teknik okulasi harus bebas dari gejala CVPD agar diperoleh bibit tanaman berkualitas baik yang bebas penyakit CVPD. Perbanyakan tanaman secara in vitro melalui kultur meristem pucuk dan subkultur jeruk Brastepu hendaknya dilakukan melalui satu kali subkuktur karena dapat menghasilkan planlet dengan kualitas baik. Untuk itu perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mendapatkan bibit tanaman berkualitas baik dalam jumlah besar agar dapat digunakan memenuhi bibit tanaman yang bebas CVPD untuk ditanam di perkebunan rakyat dan perkebunan nasional dalam rangka konservasi tanaman lokal penghasil buah dengan kuantitas dan kualitas produksi yang baik.