Isolasi, Pengklonan dan Analisis Ekspresi Gen Penyandi Heat Shock Proteins (HSPs) dari Ulat Sutera Bombyx mori L. (Lepidoptera: Bombycidae) C301

Abstract

Growth, development and productivity of silkworm (Bombyx mori) are strongly influenced by environmental temperature changes. Temperature becomes major factor in increasing the production of silk thread. Silkworm breeding in tropical climate are facing many challenges and obstacles, because silkworm eggs are originally from subtropical areas. In an effort to increase the production of in the cultivation, is expected to have silkworm which can withstand in environmental factor changes, especially temperature changes. Natural silk business development in the tropical areas is required a thermotolerant silkworm eggs. Thermotolerant to environmental factors are controlled by genes. Genes that function to the body's defense against temperature are heat shock proteins (Hsp) genes. Hsp genes can be isolated by providing a heat shock that could induce the expression of the genes. Hsp is a protein that allows cells to overcome the problem of protein that reduced after stress. Hsp is a molecule chaperones that can prevent inappropriate interactions with other cellular components, and stabilizes the protein and cell degradation. Hsp perform this role by establishing a new polypeptides or proteins during normal cellular processes. Hsp gene is functioning to response for stress induced protein denaturation. This research aims to isolate, clone and analyze the expression of genes encoding heat shock protein (Hsps) of silkworms. Silkworm eggs used in this research are derived from the local crossbreeding in Pusat Pembibitan Ulat Sutera (PPUS) Candiroto Temanggung Jawa Tengah. Hsp genes are induced by giving heat shock treatment to the silkworms. The treatment is given at 34, 38 and 42oC, and without heat shock as a control. The research was conducted in three stages: (1) Growth and development of silkworm by heat shock, (2) isolation of cDNA fragments actin gene (cDNA Bm- Act1) and (3) isolation, cloning and the expression analysis of genes encoding Hsp genes silkworm (B. mori) C301. The research began to get an overview of the growth and development of silkworm by heat shock with temperature 34, 38 and 42oC, and without heat shock as a control. Heat shock was conducted in early 4th instar for 3 hours. The results showed that heat shock treatment increase the percentage of mortality and accelerate the larval stage, in addition treatment decrease body weight by reducing growth, feed intake and digestibility. Furthermore, it also reduced productivity and lead to failure of the formation of cocoon, pupa, imago and fecundity. The next step is the isolation of total RNA in 5th instar stage from several organs, include the head, silk gland, cuticle and rectum using Trizol reagent. The results showed that the isolation of total RNA was found in the head, silk gland and rectum meanwhile the cuticle occurs lime clotting. The results of RNA quality and quantity analysis based on nanospectrophotometer uv-vis total RNA was not detected on the network cuticle due to deposition because of the insoluble total RNA by the provision of DEPC water and ddH2O. The PCR continue using total RNA that isolated for silkworm head. PCR applied QIAGEN one step (Invitrogen) with three specific primers (HspBmC, Hsp20,4 and Hsp70). The of nucleotide sequence analysis showed that the HspBmC gene fragment has a size of 712 bp homologous with B. mori heat shock proteins 25.4 with E value 0.0 (max identity 99%). Hsp20.4 gene fragment size 535 bp homologous with B. mori heat shock proteins 20.4 mRNA by E value 3e-105 (max identity 99%) and Hsp70 size 240 bp homologous with B. mori heat shock proteins 70 mRNA by E value 5e-96 (max identity 99%). To study the gene expression in silkworm quantitatively, is needed housekeeping genes as an internal controls. Housekeeping genes are often used as an internal control is actin gene. Total RNA from the larva's head used as a template for synthesis of total cDNA via reverse transcription. cDNA fragments that encode actin of B. mori C301 has been isolated. Primer used forward (5’-ATC ACC ATC GGA AAC GAA AG-3’) and reverse (5’-GGT GTT GGC GTA CAA GTC CT-3’)]. Subsequent cDNA gene fragment was named BmAct1. Alignment analysis based on the nucleotide sequences showed that Bm- Act1 has a high similarity with the B. mori isolate W5-30 actin-4 mRNA. Analysis of gene expression was performed by RT-qPCR. The results showed that the gene expression of Hsp25.4 and Hsp70 the were highest in heat shock 34oC, Hsp20.4 was highest in heat shock 42oC. Heat shock 34oC and 38oC at Hsp20.4 showed similar expression. The lowest is on Hsp70 gene expression after exposure to a temperature of 38oC. Hsp gene expression patterns which isolated from the head of the silkworm (Bombyx mori L.) C301 are having different expression patterns from other strains.

Pertumbuhan, perkembangan dan produktivitas ulat sutera (Bombyx mori) sangat dipengaruhi oleh perubahan suhu lingkungan. Suhu menjadi faktor utama dalam meningkatkan produksi benang sutera. Pemeliharaan ulat sutera pada daerah tropis menghadapi banyak tantangan dan hambatan karena bibit ulat sutera berasal dari daerah subtropis. Usaha dalam meningkatkan produksi benang diharapkan adanya bibit ulat sutera yang bisa tahan terhadap perubahan faktor lingkungan terutama suhu. Untuk mengembangan usaha persuteraan alam di daerah tropis diperlukan bibit ulat sutera yang termotoleran. Termotoleran terhadap faktor lingkungan dikontrol oleh gen. Gen yang berfungsi untuk proses pertahanan tubuh terhadap faktor suhu adalah gen Hsp (heat shock proteins). Gen Hsp dapat diisolasi dengan cara memberikan kejut panas sehingga bisa menginduksi ekspresi gen tersebut. Hsp adalah protein yang memungkinkan sel untuk mengatasi masalah protein setelah adanya stres (cekaman). Hsp merupakan molekul chaperone yang dapat mencegah interaksi yang tidak pantas dengan komponen seluler lainnya, serta menstabilkan protein dan dapat menghindari terjadinya degradasi sel. Hsp melakukan peran ini dengan membentuk polipeptida baru atau protein selama proses seluler normal. Gen Hsp berfungsi menanggapi denaturasi protein akibat stres. Penelitian ini bertujuan mengisolasi, mengkloning dan menganalisis ekspresi gen penyandi heat shock protein (Hsp) pada ulat sutera. Bibit ulat sutera yang digunakan adalah yang berasal dari hasil persilangan lokal Pusat Pembibitan Ulat Sutera (PPUS) Candiroto Temanggung Jawa Tengah. Gen Hsp diinduksi dengan memberikan kejut panas pada ulat sutera. Kejut panas yang diberikan adalah suhu, antara lain 34, 38 dan 42oC serta tanpa kejut panas sebagai kontrol. Penelitian dilakukan dalam 3 tahap yaitu (1) Pertumbuhan dan perkembangan ulat sutera yang diberi kejut panas, (2) isolasi fragmen cDNA gen penyandi aktin (BmAct) dan (3) isolasi, kloning dan analisis ekspresi gen penyandi heat shock protein (Hsp) ulat sutera (B. mori) C301. Penelitian diawali untuk mendapatkan gambaran pertumbuhan dan perkembangan ulat sutera yang diberi kejut panas yaitu suhu 34, 38 dan 42oC serta tanpa kejut panas. Kejut panas dilakukan pada awal instar IV selama 3 jam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian kejut panas dapat meningkatkan persentase mortalitas, mempercepat stadium instar, menurunkan bobot tubuh dengan cara menurunkan pertumbuhan, konsumsi pakan dan daya cerna. Selain itu juga menurunkan produktivitas serta menimbulkan kegagalan pembentukan kokon, pupa dan imago serta keperidian. Selanjutnya dilakukan isolasi RNA total ulat sutera instar V dari beberapa organ tubuh meliputi kepala, kelenjar sutera, kutikula dan rektum dengan menggunakan reagen Trizol. Hasil penelitian menunjukkan bahwa RNA total ditemukan pada kepala, kelenjar sutera dan rektum sedangkan pada kutikula terjadi penggupalan. Hasil analisis kualitas dan kuantitatif RNA menggunakan nanospectrophotometer uv-vis tidak terdeteksi adanya RNA total pada jaringan kutikula karena endapan RNA total tidak larut dengan pemberian DEPC water dan ddH2O. Isolasi fragmen gen Hsp dengan PCR menggunakan QIAGEN one step (Invitrogen) dengan 3 primer spesifik, antara lain : HspBmC, Hsp20,4 dan Hsp70. Analisis urutan nukleotida menunjukkan bahwa fragmen gen HspBmC memiliki ukuran 712 pb homolog dengan B. mori heat shock proteins 25.4 dengan E value 0.0 (max identity 99%). Fragmen gen Hsp20,4 berukuran 535 pb homolog dengan B. mori heat shock proteins 20.4 mRNA dengan E value 3e-105 (max identity 99%) dan Hsp70 berukuran 240 pb homolog dengan B. mori heat shock proteins 70 mRNA dengan E value 5e-96 (max identity 99%). Untuk mempelajari ekspresi gen secara kuantitatif pada ulat sutera dibutuhkan housekeeping gen sebagai kontrol internal. Housekeeping gen yang sering digunakan sebagai internal kontrol adalah gen aktin. RNA total diisolasi dari bagian kepala larva dan dijadikan cetakan untuk sintesis cDNA total melalui transkripsi balik. Fragmen cDNA yang menyandikan aktin dari B. mori C301 telah berhasil diisolasi. Primer yang digunakan adalah forward (5’-ATC ACC ATC GGA AAC GAA AG-3’) dan reverse (5’-GGT GTT GGC GTA CAA GTC CT-3’)]. Fragmen gen cDNA selanjutnya diberi nama Bm- Act1. Analisis kesejajaran berdasarkan urutan nukleotida menunjukkan bahwa BmAct1 memiliki kemiripan yang tinggi (99%) dengan B. mori isolat W5-30 actin-4 mRNA. Analisis ekspresi gen dilakukan dengan RT-qPCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi gen Hsp25,4 dan Hsp70 tertinggi pada kejut panas 34oC, sedangkan Hsp 20,4 tertinggi pada kejut panas 42oC. Kejut panas 34oC dan 38oC pada Hsp20,4 menunjukkan ekspresi yang hampir sama. Ekspresi gen terendah pada Hsp70 setelah pemaparan suhu 38oC. Pola ekspresi gen Hsp yang diisolasi dari kepala ulat sutera (Bombyx mori L.) C301 memiliki pola ekspresi yang berbeda dengan strain lainnya.