Deteksi Gen Notch2, CTLA-4, OXTR, EGF, dan NR2F1 Menggunakan DNA Preservasi Asal Saliva Manusia yang Diberi Kombinasi Antimikroba dan Penghambat DNAse

Abstract

DNA can be obtained from blood, biopsy tissues, buccal swabs, or saliva. There are several advantages of using saliva as a DNA source such as easy collection, non-invasive, and stability at room temperature. When compared to blood, saliva has a small amount of DNA and is possible to be broken down due to oral microorganisms. Thus, DNA preservation from saliva requires certain requirements. The combination of antimicrobials can create sterile saliva while deoxyribonuclease (DNase) inhibitors help to preserve human DNA against DNase activity. This study aimed to determine the effect of a combination of antimicrobials and DNase inhibitor on the preservation of human genomic DNA from saliva stored in closed containers at room temperature for up to 14 days. This is an experimental study using a prospective design. Saliva samples were collected from 10 subjects and divided into treatment groups (P) with the presence of 1,500 μg/mL gentamicin sulfate, 200 μg/mL clindamycin, 1,000 μg/mL ketoconazole, and 1 mM EDTA. The group without treatment (TP) was not given any chemicals. DNA from both groups (P and TP) was extracted using the spin column method based when the stored saliva samples were in 0, 3, 7, 10, and 14 days, respectively. The concentration and purity of DNA were measured using a spectrophotometric approach. Target genes (NOTCH2, CTLA-4, OXTR, EGF, and NR2F1) were detected by polymerase chain reaction (PCR) and visualized using 1% agarose gel electrophoresis and ethidium bromide. The average purity of the extracted DNA was 1.80 (1.51-2.15) and the average concentration was 27.70 ng/μL (10.00-60.75 ng/μL). The PCR of P group DNA samples showed the presence of all target gene bands (NOTCH2, CTLA-4, OXTR, EGF, and NR2F1) on days 0 to 14, while in the TP group, target gene bands disappeared on days 10. The combination of anti-microbes and DNase inhibitor can preserve human DNA from saliva in closed containers at room temperature for up to 14 days.

DNA dapat diperoleh dari darah, jaringan biopsi, swab bukal, atau saliva. Terdapat beberapa keuntungan menggunakan saliva sebagai sumber DNA yaitu mudah dalam pengumpulannya, non-invasive, dan tahan pada suhu ruang. Bila dibandingkan dengan darah, saliva memiliki kekurangan pada jumlah DNA yang sedikit dan kemungkinan kerusakan oleh keberadaan mikroorganisme oral. Dengan demikian preservasi DNA asal saliva memerlukan pertimbangan tertentu. Kombinasi antimikroba dapat menciptakan saliva steril sementara penghambat deoxyribonuclease (DNase) membantu mempreservasi DNA manusia. Tujuan penelitian ini adalah menentukan efek pemberian kombinasi antimikroba dan penghambat aktivitas DNAse terhadap preservasi DNA genom manusia asal saliva yang disimpan dalam wadah tertutup pada suhu ruang hingga 14 hari. Penelitian ini menggunakan desain eksperimental murni. Saliva dikumpulkan dari 10 subjek dan dibagi menjadi kelompok perlakuan (P) dengan penambahan 1.500 μg/mL gentamisin sulfat, 200 μg/mL klindamisin, 1.000 μg/mL ketokonazol, dan 1 mM EDTA. Kelompok tanpa perlakuan (TP) tidak diberikan tambahan apapun. DNA dari kedua kelompok (P dan TP) diekstraksi dengan metode spin column berdasarkan hari penyimpanan saliva yaitu hari ke- 0, 3, 7, 10, dan 14. Konsentrasi dan kemurnian DNA diukur dengan kaidah spektrofotometri. Gen-gen target (NOTCH2, CTLA-4, OXTR, EGF, dan NR2F1) dideteksi dengan polymerase chain reaction (PCR) dan divisualisasi dengan elektroforesis gel agarose 1% dan etidium bromida. Rata-rata kemurnian DNA hasil esktraksi adalah 1,80 (1,51-2,15) dan rata-rata konsentrasi 27,70 ng/μL (10,00-60,75 ng/μL). PCR kelompok P memperlihatkan keberadaan seluruh band gen target (NOTCH2, CTLA-4, OXTR, EGF, dan NR2F1) pada hari 0 hingga 14, sementara pada kelompok TP, band gen target menghilang pada hari ke 10. Kombinasi antimikroba dan penghambat aktivitas DNAse dapat mempreservasi DNA manusia asal saliva dalam wadah tertutup pada suhu ruang hingga 14 hari.